BRAF

Онкоген BRAF

Белок BRAF

Ген BRAF (гомолог вирусного онкогена саркомы v-Raf В) кодирует белок, принадлежащий к семейству серин/треониновых протеинкиназ Raf. Данный белок является одним из ключевых компонентов сигнального каскада MAPK. Этот путь передачи сигнала инициируется связыванием лигандов эпидермального фактора роста, что приводит к активации тирозинкиназных рецепторов на клеточной мембране. Затем происходит последовательная активация адаптерных белков, таких как GRB2 и SOS, которые в свою очередь приводят к высвобождению ГДФ (гуанозиндифосфат) из белка KRAS. Это позволяет связываться ГТФ (гуанозинтрифосфат) с KRAS, что приводит к активации последнего. KRAS, расположенный на внутренней поверхности плазматической мембраны, затем подвергается конформационному изменению, что приводит к прямому связыванию с BRAF, который после взаимодействия образует активный димер. Это в свою очередь фосфорилирует и активирует MEK, а затем ERK. Активированный ERK впоследствии транслоцируется в ядро, где он может активировать факторы транскрипции, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и выживания. Путь MAPK не является каскадом линейной передачи сигнала; существуют дополнительные белки, например, KSR1, которые регулируют ключевые компоненты каскада. Кроме того, существует механизм отрицательной обратной связи, при котором фосфорилированный ERK может ингибировать вышестоящие компоненты, и отрицательные регуляторы сигнального пути, такие как SPRY и DUSP, экспрессия которых наблюдается при активации каскада MAPK.

В своей активной форме BRAF образует димер и действует как серин/треониновая протеинкиназа. N-концевой регуляторный домен BRAF в неактивном состоянии ингибирует собственный С-концевой киназный домен. Эти димеры дополнительно стабилизируются белком 14-3-3. Члены семейства RAF состоят из трех консервативных доменов — консервативных регионов 1, 2, 3 (CR1, CR2, CR3, соответственно). Белок BRAF содержит 766 аминокислот; его область CR1 охватывает диапазон от 120 до 280 аминокислот. CR1 представляет собой ауторегуляторный домен, ингибируя собственный киназный домен CR3, что предотвращает чрезмерную активность последнего. Аминокислоты 155–227 образуют RAS-связывающий домен (RBD). При связывании ГТФ-азы RAS эта область высвобождает аутоингибирующее действие CR1 и прекращает ингибирование киназного домена CR3. В свою очередь, CR2 является серин-насыщенным шарнирным регионом, который связывает домены CR1 и CR3. CR3 представляет собой структуру с двумя лепестками и охватывает диапазон от 457 до 717 аминокислот. CR3 является каталитическим доменом серин/треониновой протеинкиназы, который фосфорилирует специфическую последовательность белков субстратов.

BRAF как драйверный онкоген

Хотя все три киназы RAF играют важную роль в нормальной физиологии, BRAF является преобладающей аберрантной киназой RAF при различных злокачественных новообразованиях (ЗНО). Среди всех ЗНО мутации в гене BRAF встречаются в 8% случаев. Было показано, что почти 60% меланом несут мутации в гене BRAF. Также мутации в этом гене присутствуют при неходжкинской лимфоме, колоректальном раке, папиллярном раке щитовидной железы, немелкоклеточном раке легкого, а также при глиобластоме. Важно отметить, что подавляющее большинство мутаций гена BRAF затрагивают аминокислотный остаток V600, обуславливая замену тимидина на аденозин в нуклеотиде 1799, что в свою очередь приводит к замене валина в глутамат. Эта мутация приводит к отрицательному заряду T599, расположенному рядом с сайтом фосфорилирования, который достаточен для того, чтобы вызвать конститутивную активацию BRAF вне зависимости от передачи сигнала от вышележащих компонентов каскада.

Как правило, мутации в гене BRAF были идентифицированы с использованием таргетных методов анализа точечных мутаций аллеля V600, таких как аллель-специфическая ПЦР. Недавно разработанная технология секвенирования следующего поколения позволила проводить эффективный анализ экзонов нескольких генов, а также всего генома. Одной из платформ для анализа последовательности экзома является MSK-IMPACT. С ее помощью было выявлено наличие мутаций в гене BRAF не в аллели V600. Исследование с помощью данной платформы почти 10 000 образцов метастатического колоректального рака, показало, что мутации в гене BRAF, не относящиеся к аллели V600, имели место в 2,2% случаев. При этом, подавляющее большинство случаев обнаружено в опухолях с геномом, характеризующимся микросателлитной стабильностью. Стоит отметить, что данные мутации, не относящиеся к аллели V600, имели отличные от мутации V600E ассоциации с клиническими проявлениями. Так, не-V600E мутации были связаны с более молодым возрастом, мужским полом. Также опухоли, несущие данный тип мутаций, ассоциированы с левосторонней локализацией колоректального рака и высокой степенью дифференцировки. Кроме того, опухоли с не-V600E аберрациями ассоциированы с более высокими показателями общей выживаемости по сравнению как с образованиями с наличием BRAF V600E, так и с образованиями с наличием BRAF дикого типа.

Мутации в гене BRAF могут быть подразделены на три группы в зависимости от их влияния на активность белка BRAF. BRAF-мутации 1 класса включают мутации V600, которые приводят к конститутивной RAS-независимой активации белка в виде мономера. Мутации 2 класса, не-V600 тип мутаций, приводят к конститутивной RAS-независимой киназной активации белка в виде образования димера. Недавно был идентифицирован третий класс мутаций BRAF, при которых нарушена либо отсутствует автономная киназная активность. Активация такого аберрантного белка происходит в виде образования димера и зависит от активации KRAS. При мутациях 3 класса также происходит фосфорилирование MEK и ERK, но в меньшей степени, чем при мутациях 1 и 2 классов. В недавних исследованиях показано, что вероятность появления мутаций 3 класса была два раза выше, чем мутаций 2 класса.

Мутация 1 класса (BRAF V600E), а также мутации 2 класса обеспечивают конститутивную активацию пути; следовательно, сосуществование мутации в гене KRAS является избыточной, о чем свидетельствует взаимоисключаемость этих двух типов мутаций в одной опухоли. Напротив, мутации BRAF 3 класса зависят от активирующих мутаций в гене KRAS, следовательно, могут сосуществовать и даже взаимодействовать с аберрантным KRAS.

В недавних публикациях также было показано, что перестройки онкогенов BRAF могут приводить к активации BRAF при меланоме и других типов рака. В этих случаях происходит слияние киназного домена BRAF с N-концевым партнером следующих генов: SOX10, AGK, SEPT3. Перестройки приводят к изменению числа копий BRAF и его активности, которая не зависит от миссенс-мутаций в гене BRAF. Были показаны клинико-морфологические различия опухолей с транслокациями гена BRAF и опухолей с миссенс-мутациями BRAF.

Мутации в гене BRAF и иммунный клеточный состав микроокружения опухоли

Микроокружение опухоли состоит из клеток и растворимых элементов. К ним относятся фибробласты, иммунные клетки и клетки, образующие кровеносные сосуды. Микроокружение также включает белки и растворимые медиаторы, продуцируемые клеточной средой, которые в конечном итоге поддерживают рост опухоли. В настоящее время распространено мнение, что прогрессированию заболевания способствует взаимодействие между злокачественными клетками и окружающей их средой. Это взаимодействие частично связано с изменениями в результате мутаций генов, которые оказывают влияние на состав опухолевого микроокружения. В связи с этим в ряде опухолей, например, в меланоме и дифференцированном раке щитовидной железы, было показано, что мутация V600E в гене BRAF связана с рядом иммунных нарушений.

По сравнению с BRAF-отрицательными опухолями, микроокружение опухолей, несущих мутации в гене BRAF, характеризуются вдвое большим содержанием регуляторных Т-клеток FOXP3 + (Tregs), которые ингибируют противоопухолевый иммунный ответ и, как следствие, ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. В BRAF-положительных опухолях меланомы человека  был продемонстрирован дополнительный механизм, ускользания от иммунологического надзора, при котором происходит ослабление противоопухолевого ответа Т-клетками путем увеличения транскрипции интерлейкина 1 альфа (IL-1a) и бета (IL-1b) в опухоль-ассоциированных фибробластах, в результате чего снижается их способность к киллингу клеток меланомы.

С помощью секвенирования РНК при папиллярном раке щитовидной железы было показано, что наличие мутации в гене BRAF ассоциировано со снижением экспрессии генов иммунного/воспалительного ответа по сравнению с опухолями, имеющих BRAF дикого типа. В свою очередь отмечалась высокая экспрессия иммуносупрессивных молекул, в том числе человеческий лейкоцитарный антиген G (HLA-G), в опухолях с мутацией BRAF. Кроме того, было обнаружено, что лиганд рецептора программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1) и его мРНК экспрессируются значительно выше в операционных образцах BRAF-положительных опухолей по сравнению со здоровыми тканевыми образцами. Такая высокая экспрессия PD-L1 была связана с более высоким уровнем инфильтрации Treg клеток и опухоль-ассоциированных макрофагов. По результатам анализа экспрессионного профиля генома инфильтрирующих иммунных клеток микроокружения при раке щитовидной железы была показана избыточная экспрессия группы генов, участвующих в процессах локальной иммуносупрессии. Они включали гены цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена 4 (CTLA4), PD-L1 и HLA-G.

Терапия при BRAF-положительных опухолях

Расширение знаний о биологии аберрантного белка BRAF позволили выявить и разработать низкомолекулярные ингибиторы, которые специфически инактивируют каталитическую активность BRAF. Эти фармакологические разработки и их итеративные улучшения были не только клинически значимыми, но и помогли понять физиологическую роль белков семейства RAF. Несколько конкурентных и аллостерических ингибиторов АТФ, которые связывают и нарушают каталитическую киназную активность BRAF, были исследованы в клинической практике. Сорафениб был первым разработанным ингибитором BRAF и был исследован при меланомах. Данный препарат является киназным ингибитором широкого спектра действия и нацелен на BRAF дикого типа, аберрантный белок BRAFV600E и CRAF, а также VEGFR, PDGFR, CKIT и FLT3. Определение оптимальной дозы для этого препарата оказалось затруднительным из-за отсутствия специфичности к аберрантному белка и одновременному действию на несколько мишеней. Сорафениб оказался неэффективным для лечения меланомы как в режиме монотерапии, так и в сочетании с химиотерапией.

Вемурафениб, один из первых специфических ингибиторов аберрантного BRAF, специфичен в отношении BRAFV600E. Первоначально он был одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения распространенной меланомы. Так, в I фазе клинического исследования вемурафениба было показано стабилизация заболевания, а в некоторых случаях выраженная регрессия BRAFV600E-положительных меланом. Кроме того, клиническое исследование II фазы продемонстрировало увеличение частоты объективного ответа (ЧОО) и средней продолжительности ответа в группе вемурафениба. В ходе III фазы медиана выживаемости без прогрессирования (ВБП) в группе с вемурафенибом составила 5,3 месяцев по сравнению со стандартной системной терапией- медиана PFS 1,6 месяцев. Дабрафениб, другой специфичный ингибитор мутантного BRAF также был одобрен FDA в 2013 году. Результаты III фазы клинического исследований данного препарата также показали увеличение ЧОО и ВБП. Результаты данных исследований были также воспроизведены и при классическом волосатоклеточном лейкозе, которая содержит мутацию V600E в гене BRAF.

При BRAF-мутантном колоректальном раке и раке щитовидной железы ингибиторы BRAF не продемонстрировали большого клинического эффекта в качестве монотерапии. Кроме того, у некоторых пациентов с BRAF-положительными опухолями были обнаружены парадоксальные пути активации сигнального пути MAPK при ингибировании BRAF. Такая активация пути приводила к появлению у пациентов плоскоклеточного рака кожи. У этих пациентов были обнаружены вторичные мутации в гене HRAS. Данные мутации, обусловленные парадоксальной активацией пути MAPK ингибитором BRAF, представляют собой механизм индукции вторичных новообразований кожи. Также стоит отметить, что длительность монотерапии ингибитором BRAF ограничена появлением лекарственной устойчивости.

Ингибиторы MEK также активно изучались при BRAF-положительных опухолях и ​​других опухолях с мутациями в генах, участвующих в сигнальном пути MAPK. По результатам исследований I и II фаз при меланоме кожи было продемонстрировано увеличение показателей ВБП и общей выживаемости (ОВ) при использовании ингибитора MEK траметиниба. При BRAF-мутантной меланоме использование другого ингибитора MEK кобиметиниба показало сходные результаты. Ингибиторы MEK не показали парадоксального активации пути MAPK, наблюдаемого при использовании вемурафениба и дабрафениба. Однако эффективность ингибиторов MEK в качестве монотерапии относительно скромна, в то время как комбинация ингибиторов BRAF и MEK при BRAF-положительных злокачественных новообразованиях продемонстрировала высокую эффективность. Следовательно, комбинированное лечение ингибиторами BRAF и MEK, такими как дабрафениб + траметиниб и вемурафениб + кобиметиниб было одобрено FDA для пациентов с BRAFV600E-положительной распространенной меланомой. Комбинированная терапия ингибиторами BRAF и MEK у пациентов, не получавших ранее системной терапии, показала более высокую ЧОО, чем монотерапия ингибиторами BRAF. При метастатической меланоме комбинированное лечение дабрафенибом и траметинибом продемонстрировало медиану ОВ 27,4 месяца по сравнению с 17,4 месяцами для монотерапии дабрафенибом. Результаты данного исследования привело к использованию двойного ингибирования BRAF и MEK в качестве стандарта лечения у данной группы пациентов.

Результаты данных исследований привело к значительному прогрессу в лечении BRAF-положительного немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). В 2017 году Planchard и др. показали, что во II фазе клинического исследования комбинированного лечения дабрафенибом и траметинибом достигнут впечатляющий показатель ЧОО- 64%. Наиболее распространенной мутацией BRAF при НМРЛ является мутация BRAF V600E, на которую приходится примерно 50% BRAF-положительных опухолей. По результатам исследования комбинация дабрафениба и траметиниба была одобрена FDA в 2017 году для лечения пациентов с распространенным НМРЛ, у которых обнаружена мутация BRAF V600E.

При метастатическом колоректальном раке Corcoran и др. показали, что комбинация дабрафениба и траметиниба имеет показатель частичного или полного ответа 12% (5 из 43 пациентов). В последующем исследовании они также показали, что комбинированная инактивация BRAF, MEK и EGFR (с использованием анти-EGFR антител- панитумумаба) достигает более высокого уровня ответа — 21% (19 из 91) у BRAFV600E-положительных пациентов. Такое увеличение эффективности обусловлено предполагаемой роли EGFR-опосредованной реактивации сигнального пути MAPK в определенных BRAFV600E-положительных опухолях при воздействии ингибиторами BRAF.

Поскольку BRAF является непосредственным регуляторным компонентом сигнального пути MAPK и поскольку активация пути MAPK является одной из наиболее частых онкогенных событий в опухолевых клетках, инактивация BRAF может быть направлена ​​на широкий спектр злокачественных опухолей, имеющих аберрантную активность данного сигнального пути. Однако механизмы регулирования деятельности BRAF в настоящее время признаны более сложными, чем предполагалось. Например, накапливающиеся данные указывают на необходимость димеризации белков семейства RAF для RAS-зависимой активации киназы RAF в нормальных клетках. В этом контексте, хотя BRAF может димеризоваться с любым из членов семейства RAF, считается, что гетеродимеры BRAF-CRAF преобладают. В свою очередь, в опухолях наблюдается дисфункциональная регуляция: (1) мутантный BRAF часто может выполнять сигнальную функцию независимо от RAS; (2) V600E-мутантные белки BRAF могут осуществлять передачу сигналов в качестве мономеров; и (3) белки RAF могут гомодимеризоваться (по типу BRAF-BRAF, CRAF-CRAF). Исходя из этих принципов, парадоксальная активация сигнального пути MAPK может происходить и при инактивации BRAF в опухолях, несущих мутации в генах семейства RAS. Это часто обусловлено аллостерической стабилизацией гетеродимеров BRAF-CRAF. В соответствии с этим, димеризация BRAF приводит к снижению ответа на применяемую таргетную терапию. Rosen и др. также продемонстрировали, что конкурентные ингибиторы АТФ, которые нацелены на киназную активность BRAF, по-видимому, действуют на мономерный мутантный (например, V600E) белок BRAF, но почти не влияют на мутантные белки BRAF, которые образуют димеры. В 2015 году Zhang и др. продемонстрировали, что фармакологические ингибиторы, которые связываются с протомерами белков RAF и избирательно нарушают образование димеров, могут блокировать парадоксальную активацию сигнального пути MAPK. Эти наблюдения привели к активным изучениям ингибиторов домена димеризации в качестве терапевтической стратегии. Более того, для опухолей с мутациями BRAF 3 класса, которые зависят от RAS, недавние исследования продемонстрировали, что использование ингибиторов SHP2 позволяет снизить передачу сигнала по пути MAPK за счет препятствования димеризации RAS-GTP и белков семейства RAF.

Устойчивость к терапии ингибиторами BRAF

Несмотря на заметную раннюю ремиссию и общее улучшение исходов, устойчивость к таргетной терапии BRAF/MEK-ингибиторами неизменно возникает. Резистентность к терапии можно разделить на три категории: первичная, адаптивная и приобретенная резистентность. Первичная резистентность указывает на изначальное отсутствие ответа на проводимую терапию. Например, опухоли, несущие мутацию BRAF V600E, не отвечают на вемурафениб и траметиниб из-за наличия сосуществующей амплификации циклина D1 и высокой экспрессии YAP1. И наоборот, устойчивость к таргетной инактивации BRAF/MEK также может возникать из-за адаптации de novo эпигенетических и транскрипционных программ, приводящих к адаптивной устойчивости и частичному ответу на терапию. Например, недавние публикации указывают, что адаптивная активация транскрипционного фактора NFκB обеспечивает устойчивость к ингибиторам сигнального пути MAPK. Приобретенная резистентность возникает из-за селективного давления, оказываемого терапией на генетически гетерогенную опухоль, и/или из-за приобретенных изменений de novo. Активация параллельных сигнальных путей и появление мутаций в генах сигнального пути представляют собой примеры приобретенной устойчивости.

Первичная резистентность

Изменения генов, регулирующих клеточный цикл, являются одним из примеров механизма первичной резистентности в BRAF-мутантных опухолях. Smalley и др. продемонстрировали, что сопутствующие мутации в циклинзависимой киназе 4 (CDK4) препятствуют ответу на инактивацию BRAF у BRAF-положительных пациентов. Другими примером является амплификация гена CCND1, которая отмечена в 15–20% BRAF-положительных меланомах и может способствовать резистентности к терапии.

Потеря гетерозиготности гена-супрессора PTEN также демонстрирует низкий ответ на лечение ингибитором BRAF. Nathanson и соавт. показали, что вне зависимости от лечения при меланоме у пациентов с потерей гена PTEN были более низкие показатели ВБП по сравнению с пациентами с диким типом гена PTEN: 18,3 недели против 32,1 недели. PTEN регулирует сигнальный путь фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K), который является хорошо изученным онкогенным каскадом при различных злокачественных новообразованиях. Эти наблюдения подтверждают стратегии двойного ингибирования PI3K и BRAF у пациентов с меланомой с потерей гена PTEN.

Изменения в сигнальном пути MAPK также участвуют в резистентности в BRAF-положительных опухолях. Johannessen и др. показали, что увеличение количества копий MAP3K8 (также известное как COT) приводит к устойчивости к ингибитору BRAF посредством реактивации пути MAPK. В свою очередь, Whittaker и др. показали, что потеря гена NF1, который препятствует избыточной передачи сигналов по каскаду MAPK, опосредует устойчивость к ингибиторам RAF и MEK посредством устойчивой активации пути MAPK.

Первичная резистентность к ингибиторам MAPK также может быть обусловлено белком YAP, который является частью сигнального пути Hippo. YAP является ко-активатором транскрипции. Активация пути Hippo вызывает цитоплазматическую секвестрацию и/или протеолитическую деградацию YAP, ведущую к ослаблению YAP-опосредованной транскрипции. Было показано, что YAP является медиатором устойчивости к ингибиторам BRAF. Lin и соавт. продемонстрировали, что высокая экспрессия YAP1 была связана с устойчивостью к лечению ингибитором BRAF на доклинических моделях и с низкой выживаемостью в группе пациентов с меланомой и пациентов с НМРЛ, получавших ингибиторы BRAF. В доклинических моделях было показано, что ингибирование YAP приводит предотвращению устойчивости к ингибиторам BRAF.

Адаптивная резистентность

Транскрипционная и эпигенетическая перестройки представляют собой один из ключевых механизмов лекарственной устойчивости. Например, адаптивная высокая экспрессия фактора роста гепатоцитов (HGF), а также низкая экспрессия генов CTLA4, BIM и антиген-презентирующих генов (B2M, HLA-A, HLA-B и TAP1) являются механизмом устойчивости опухоли к ингибиторам BRAF. Кроме того, в физиологических условиях усиление пути MAPK активирует петлю отрицательной обратной связи, которая ослабляет стандартную передачу сигналов с тирозинкиназных рецепторов.

Приобретенная устойчивость

Большинство приобретенных механизмов устойчивости в BRAF-положительных опухолях происходит путем реактивации пути MAPK. Например, при воздействии ингибиторов BRAF в BRAF-положительной меланоме наблюдалось появление активирующих мутаций в генах NRAS и MEK1/2 и высокий уровень экспрессии белка CRAF. Кроме того, приобретенная резистентность при меланоме или раке легкого может обусловлена избыточной экспрессией BRAFV600E и появлением различных вариантов сплайсинга BRAF наблюдались при меланоме или раке легкого.